1.2 基因工程的基本操作程序 （共85张PPT）

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人教版选修三1.2 基因工程的基本操作程序基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程的基本操作程序（1）目的基因的获取

（2）

（3）将目的基因导入受体细胞

（4）目的基因的检测与鉴定基因表达载体的构建一、目的基因的获取1、目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

2、获取方法：

（1）从基因文库中获取目的基因；

（2）利用PCR技术扩增目的基因；

（3）通过DNA合成仪用化学方法直接合成（一）从基因文库中获取目的基因1.什么叫基因文库？

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子 RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。 转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。 转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。①不能转录为信使RNA，不能

编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能

编码蛋白质 编码区非编码区原核细胞的 基因结构②有调控遗传信息表达的核

苷酸序列，在该序列中，

最重要的是位于编码区上

游的RNA聚合酶结合位点。非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 启动子终止子补：真核细胞的基因结构编码区与RNA聚合酶

结合位点内含子 外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游 编码区下游 内含子： 外显子： 真核细胞的 基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列

内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，

包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子结构基因外显子内含子转录、加工修饰mRNA原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码基因表达的计算在真核生物中，对应的是 的碱基数6 3 1氨基酸数碱基数？补充资料基因中外显子基因组文库与部分基因文库的关系基因组文库和部分基因文库的比较小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以概念辨析基因文库与基因库 基因库是指某一生物群体中的全部基因。 基因文库与基因克隆基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。

基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。 基因组文库的构建模式图通过对

受体菌

的培养而储存基因2.基因文库的构建方法（1） 鸟枪法

（2） 反转录法

（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 人工合成法（真核生物）多用于原核生物直接分离法（1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)（2）反转录法（cDNA文库的构建方法） 以目的基因转录成的信使RNA为模板，再反转录酶的催化下反转录成互补的单某某DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成某某DNA，即cDNA，从而获得所需的基因。

（3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考：

如何从基因文库中得到所需要的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列；

基因的功能；

基因在染色体上的位置；

基因的转录产物mRNA；

基因翻译产物蛋白质等特性。注意：基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。（二）利用PCR技术扩增目的基因PCR反应PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点重复1~3步

25~30轮目的DNA片段

扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单某某

与引物复性DNA变性

形成2条单某某子链延伸

DNA加倍模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点引物1引物2PCR的基本原理PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点第2轮结束① 概念：PCR全称为_______________，是一项

在生物____复制___________的核酸合成技术。 ③前提条件：_______________________；

原料：___________、___________ 、 __________________、 ________________。②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循

环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸DNA引物热稳定DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增模板DNA 过程：变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单某某DNA

退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单某某DNA的特定互补部位相配对和结合

延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板

在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从

引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补

的________。 氢键单某某DNA双链DNA链思考？1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，

理论上至少需要几个引物？2×（2n-1）(n为循环次数)（24-1）×2=30模板DNA

特异性引物

耐热DNA聚合酶

dNTPs

Mg2+ PCR体系基本组成成分一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段某某PCR总结：PCR的基本反应步骤变性

90-95?C延伸

70-75?C退火

55-60?CPCR总结：Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度(℃)40 50 60 70 80 90 100100

80

60

40

20PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解某某解某某酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子PCR的基本原理PCR反应条件

PCR过程

PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增 根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（三）化学方法人工合成目的基因人工合成(基因比较小)DNA合成仪从基因文库中获取

利用PCR技术扩增

利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法 用一定的_________切割

质粒，使其出现一个切

口，露出____________。

用_____________切断目

的基因，使其产生_____

____________。 将切下的目的基因片段插入质粒的______处，

再加入适量___________，形成了一个重组

DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶1.过程:二、构建表达载体—— 核心质粒DNA分子限制酶处理一个切口

两个黏性末端两个切口

获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种过程:2.基因表达载体的目的

（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代；

（2）使目的基因能够表达和发挥作用。

科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功。

起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。

然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资 料:思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？（P15） 不可以。

因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。

必须构建上述元件的主要理由是：（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子（增强基因启动子工作效率的顺式作用序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。）等；（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。3.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因调节基 因操纵基 因结构基因RNA聚合酶半乳糖苷酶 酶 酶 启动子RNA聚合酶启动子：位于基因首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。思考1： 表达载体为什么一定要有启动子？（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；

（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。思考2：终止子的作用是什么？

终止子是位于基因尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。思考3：标记基因有什么作用？①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。注意②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。基因工程技术路线三、将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。（一）转化： 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达（二）方法将目的基因导入

植物细胞将目的基因导入

动物细胞将目的基因导入

微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞1.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法

基因枪法

花粉管通道法（1）农杆菌转化法①特点：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。③转化过程:Ti质粒

目的基因构建表达载体植物细胞植物细胞染色DNA

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